Procedimiento de medición de la CE

Question

La mayoría de los procedimientos que aparecen en Internet son de nivel de laboratorio de investigación universitario. ¿Hay algún método más sencillo que pueda utilizar para determinar la concentración de EGCG

Answer 1

Estoy llevando a cabo un proyecto de investigación escolar sobre las propiedades antioxidantes del té verde. Parte del procedimiento consiste en determinar la concentración de antioxidante en el té verde. Este antioxidante es EGCG (un tipo de catequina ).

En primer lugar, no se puede determinar la concentración sólo de EGCG (galato de epigalocatequina), porque cualquier extracto de té verde contiene otros polifenoles además de EGCG, entre los que se incluyen la catequina y/u otros flavonoides como flavanoles, flavandioles y ácidos fenólicos. La mayoría de los polifenoles del té verde son flavonoles, conocidos comúnmente como catequinas que son flavan-3-oles (Ref.1):

Como se muestra en el diagrama, hay cuatro tipos de catequinas que se encuentran principalmente en el té verde: epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC), epicatequina-3-galato (ECG) y epigalocatequina-3-galato (EGCG). La cantidad de catequinas varía en las hojas de té originales debido a las diferencias de variedad, origen, época de recolección y condiciones de cultivo. Además, la preparación del té verde fresco no puede extraer totalmente las catequinas de las hojas, por lo que la cantidad determinada por usted puede no reflejar los valores absolutos determinados mediante la extracción completa de las hojas. Por lo tanto, sus conclusiones pueden diferir del beneficio exacto del té verde.

No obstante, existen métodos para determinar el contenido en polifenoles de un extracto concreto como cantidad equivalente a una referencia. Fácilmente, su referencia podría ser el ácido gálico. Un método fácil que he encontrado en la literatura es la estimación del contenido fenólico total y otros sustratos de oxidación utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu* (Ref.2; se adjunta PDF para mayor comodidad):

Determinación de Polifenoles Totales por el Método Folin-Ciocalteu: Un mililitro del extracto de té se diluyó con agua hasta $\pu{100 mL}$ . La solución de extracto diluida $(\pu{1.0 mL})$ se mezcló con $\pu{5.0 mL}$ de reactivo Folin-Ciocalteu al 50%. Después de $\pu{5 min}$ , $\pu{4.0 mL}$ del 7,5 $\ce{Na2CO3}$ y se mezcló. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante $\pu{60 min}$ . La absorbancia de la solución se midió a $\pu{765 nm}$ con un espectrofotómetro UV-Vis Shimadzu UV-2550 frente a un blanco de reactivo. La determinación se realizó tres veces. El contenido total de polifenoles se expresó como equivalentes de ácido gálico (GAE, unidades: $\pu{g}/\pu{100 g}$ muestra).

Preparación del extracto de té: Cada muestra de té se molió hasta obtener un polvo fino y se $\pu{1.0 g}$ del polvo se extrajo con $\pu{25 mL}$ de metanol/agua (7 : 3, v/v) en un baño de agua a $\pu{70 ^\circ C}$ para $\pu{10 min}$ . La extracción se repitió dos veces y los extractos se combinaron. Tras la filtración a través de un papel de filtro y un $\pu{0.45 \mu m}$ filtro de membrana (Millipore), el volumen del extracto se ajustó a $\pu{100 mL}$ .

Según el procedimiento, sólo necesitas un espectrofotómetro en el rango visible (no necesitas un espectrofotómetro UV-Vis, que es caro). Si no dispone de un equipo de filtración por membrana, puede extraer las hojas sin pulverizarlas, pero necesitará más tiempo de extracción (puede preparar previamente el extracto durante la noche a $\pu{70 ^\circ C}$ utilizando el mismo sistema de disolventes). Si desea comprobar el té verde como los preparamos para beber, utilizar de esa manera, pero puede que tenga que ajustar las concentraciones de reactivos en consecuencia para probar.

Si usted tiene un lector de placas de 96 pocillos y algunos micro-pipetas, hay un método fiable de alto rendimiento se enumeran en la Ref.3 para el mismo método (PDF del documento se ha adjuntado para comparar).

---

* Nota: El reactivo de Folin-Ciocalteu es un reactivo redox específico que contiene fosfotúngstico-fosfomolibdeno. La reacción forma un cromóforo azul constituido por un complejo fosfotúngstico-fosfomolibdeno con fenoles que puede cuantificarse por espectrofotometría de luz visible (Ref.4,5).

El ácido gálico podría utilizarse como patrón de calibración para esta determinación y los fenoles totales podrían indicarse como equivalente de ácido gálico (GAE). Otra alternativa es el pirogalol. Elija el intervalo de concentración suficiente para dar una absorbancia de 0,4-1,0 (a $\pu{760 nm}$ ) para que el ensayo sea lineal (Ref.5). A continuación se muestra la curva de calibración publicada para el ácido gálico utilizando el ensayo de Folin-Ciocalteu (Ref.6):

El procedimiento utilizado: En resumen, alícuotas de una solución patrón de ácido gálico $(20, 40, 60, 80, \pu{100 mg L-1})$ se mezclaron con $\pu{500 \mu L}$ de reactivo Folin-Ciocalteu (previamente diluido 10 veces con agua destilada) y $\pu{400 \mu L}$ de $\ce{Na2CO3}$ (7%). Después de $\pu{40 min}$ de incubación a temperatura ambiente $(\pu{23 \pm 2 ^\circ C})$ la absorbancia se midió a $\pu{760 nm}$ utilizando un espectrofotómetro frente a una muestra en blanco.

Tenga en cuenta que la temperatura de $\pu{23 ^\circ C}$ hora de $\pu{40-60 min}$ y $\lambda = \pu{760 nm}$ son condiciones optimizadas para el ensayo de Folin-Ciocalteu (Ref.5). Asegúrese también de añadir $\ce{Na2CO3}$ solución al menos después de $\pu{10 min}$ de la adición del reactivo Folin-Ciocalteu (no antes). El reactivo Folin-Ciocalteu es inestable en condiciones alcalinas.

---

Referencias:

1. Sarah C. Forester y Joshua D. Lambert, "Efectos antioxidantes del té verde". Mol. Nutr. Food Res. 2011 , 55(6) , 844-854 (doi:10.1002/mnfr.201000641)( PDF ).
2. Chunjian Zhao, Chunying Li, Shuaihua Liu y Lei Yang, "The Galloyl Catechins Contributing to Main Antioxidant Capacity of Tea Made from Camelia sinensis en China". Revista del Mundo Científico 2014 , Artículo ID 863984 (11 páginas) (doi: https://doi.org/10.1155/2014/863984 )( PDF ).
3. Elizabeth A Ainsworth1 y Kelly M Gillespie, "Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent" (Estimación del contenido fenólico total y otros sustratos de oxidación en tejidos vegetales mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu). Protocolos naturales 2007 , 2(4) , 875-877 (doi:10.1038/nprot.2007.102)( PDF ).
4. P. Schofield, D. M. Mbugua, y A. N. Pell, "Analysis of condensed tannins: a review" (Análisis de taninos condensados: una revisión). Ciencia y tecnología de la alimentación animal 2001 , 91(1-2) , 21-40 (doi: https://doi.org/10.1016/S0377-8401(01)00228-0 ).
5. Andressa Blainski, Gisely Cristiny Lopes y João Carlos Palazzo de Mello, "Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense L.," Moléculas 2013 , 18 6852-6865 ( doi:10.3390/molecules18066852).
6. A. Bouyahya1, N. Dakka, A. Talbaoui, N. El Moussaoui, J. Abrini, and Y. Bakri, "Phenolic contents and antiradical capacity of vegetable oil from Pistacia lentiscus (L)," Revista de Ciencias Materiales y Medioambientales 2018 , 9(5) , 1518-1524 (doi: https://doi.org/10.26872/jmes.2018.9.5.167 ).