HPLC: área de pico frente a la concentración

Question

Muchos libros de texto dicen que existe una proporcionalidad entre el área del pico del cromatograma y la concentración. Sin embargo, en mi opinión, debería haber una proporcionalidad entre la concentración y la intensidad del pico, no el área del pico. La intensidad del pico aumenta proporcionalmente con respecto a la absorbencia de la sustancia. Por lo tanto, utilizando la ley de Beer-Lamberant, podemos inducir que existe una proporcionalidad entre la intensidad del pico y la concentración.

¿Existe alguna relación matemática entre el área del pico y la concentración?

Se agradecerá cualquier ayuda.

Answer 1

Sin embargo, en mi opinión, debería haber una proporcionalidad entre la concentración y la intensidad del pico, no el área del pico.

Existe una proporcionalidad entre el área del pico frente a la concentración y la altura del pico frente a la concentración.

1. La altura del pico es proporcional a la instantánea cantidad de analito que transita por el detector.

2. El área del pico es proporcional al suma de todos los moléculas de analito que han transitado por el detector.

3. A partir de 1 y 2 se puede deducir la relación entre la altura de los picos $h$ y el área $A$ : $$A = \int{h(t)\;dt}$$

4. La gente suele estar interesada en el cantidad total de sustancia inyectada en la columna. (Si conocen el volumen de inyección, pueden calcular la concentración a partir de este valor). El cantidad total de sustancia se calcularía a partir del área del pico.

5. El máximo La altura del pico es proporcional al área del pico, pero sólo si la "forma" del pico es constante . He aquí algunos escenarios en los que la forma del pico no será constante:

   1. Quieres comparar la inyección #2 que hiciste en tu columna hace dos años con la inyección #2000 que hiciste recientemente. Debido a la degradación de la columna, las inyecciones recientes tienen mucho más cola del pico . Dado que la cola más larga conduce a picos más anchos y asimétricos, habrá menos altura total en el pico máximo en relación con los picos "mejores" y simétricos.
   2. Se cambia el caudal de la HPLC. Todos los picos son más estrechos y, por tanto, más altos.
   3. La tasa de exploración de su detector cambia, y el detector informa de los "recuentos" o la "intensidad" en lugar de los recuentos por tiempo. Esto es muy habitual en los espectrómetros de masas, pero menos en los detectores de absorbancia. Si se escanea el doble de rápido en EM, la altura de los picos se reduce aproximadamente al doble, pero se tienen puntos de datos con el doble de frecuencia, por lo que el área de los picos no cambia relativamente.
   4. Su detector submuestrea el pico. Digamos que su cromatografía es buena y que la forma del pico "real" es bien gaussiana, pero tiene una anchura de unos diez segundos y su detector sólo le da un punto de datos cada dos segundos. Digamos que, debido a pequeñas desviaciones aleatorias en el tiempo de retención, en algunas inyecciones uno de los puntos de datos coincide exactamente con el máximo del pico "real", pero en otros, está un poco desviado. Las alturas de los picos en este escenario variarán considerablemente más que las áreas de los picos. (Si el máximo registrado está descentrado del máximo real, habrá dos puntos de datos más altos, es decir, "más cercanos" al máximo que si el máximo de datos coincide con el máximo real, por lo que la integración corregirá parcialmente este error). Esencialmente, el máximo del pico es una muestra de un solo punto de la distribución gaussiana del pico, mientras que el área es una muestra de varios puntos de la distribución gaussiana, por lo que tiene mejores propiedades de muestreo.

¿Existe alguna relación matemática entre el área del pico y la concentración?

Sí, lo hay, pero depende de la forma del pico. Para picos perfectamente gaussianos, $$h_{max} = \frac{A}{\sigma \sqrt{\tau}}$$

donde $\tau$ es $2 \pi$ y $\sigma$ es la anchura del pico, que está relacionada con el ancho total a medio máximo del pico por $\mathrm{FWHM} = 2 \sigma \sqrt{2 \ln 2}$ .

Sin embargo, para los picos no gaussianos, esta relación no se mantiene.