¿Cómo se determina la concentración de una muestra utilizando la longitud de onda y la absorbencia? Digamos que nuestra longitud de onda para una muestra de Rojo 40 es de 508,50 nm y la absorbencia es de 0,283 cuando usamos 6 ml de agua y 4 ml de Rojo 40. ¿Cuál sería nuestra concentración y la pendiente ε? Esto es realmente frustrante, así que cualquier ayuda sería apreciada.
Respuesta
¿Demasiados anuncios?
Randy Orrison
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No sé nada sobre el rojo 40, pero necesitarás el coeficiente de extinción. Quizás lo hayas determinado a partir de un gráfico de concentración vs ¿absorbancia en el laboratorio?
Voy a intentar responder a su pregunta con referencia a NADH que tiene un coeficiente de extinción aceptado de 6220 M -1 .cm -1 a 340 nm.
Digamos que tengo una solución de NADH en un tubo de ensayo, tomo 4 ml de ésta y la diluyo con agua hasta 10 ml. A continuación, tomo esta solución diluida y mido su absorbancia a 340 nm en un espectrofotómetro utilizando una cubeta con una longitud de paso de 1 cm. El valor que obtengo es 0,4. (Editar. En la medición anterior, tengo la precaución de "poner en blanco" el espectrofotómetro frente al agua).
¿Cuál es la concentración de NADH en la solución original?
De la ley de Beer-Lambert (donde c es la concentración)
0,4 = 6220 x c x 1
Por lo tanto,
c = 0,64 x 10 -6 M = 0.64 µ M
Pero la solución sobre la que se hizo la medición era diluida 4 en 10 o 1 en 2,5
Por lo tanto, la concentración de NADH en la solución original es
c = 2,5 x 0,64 x 10 -6 M = 160,77 x 10 -6 M = 160.77 µ M
Así, la concentración de NADH en la solución original es de aproximadamente 161 µ M (micromolar).
Estoy haciendo una serie de suposiciones aquí, la principal es que el espectrofotómetro obedece la ley de Beer-Lambert en la región de absorbancia de interés. Debes determinar que esto es así midiendo la absorbancia de series de soluciones de NADH y asegurarte de que el gráfico resultante de absorbancia frente a concentración es lineal y pasa por el origen .
Como mínimo, duplicar la concentración de NADH debería duplicar exactamente la absorbancia (0,8) y reducirla a la mitad debería dar exactamente la mitad de la absorbancia (0,2). Además, la medición del agua (o lo que sea que se esté "blanqueando") debería dar cero, es decir, el espectrofotómetro debería estar correctamente "blanqueado". Si no es así, tendrá que restar este valor.
Entonces, ¿qué sucede si no diluimos nuestra muestra original, sino que simplemente medimos la absorbancia a 340 nm directamente?
De Beer-Lambert
A = 6220 x 160,77 x 10 -6 \= 1
Se prevé que la solución original tenga una absorbencia de 1, pero, en mi opinión, incluso con los espectrofotómetros modernos se está "tentando a la suerte" al suponer que Beer-Lambert se cumple con una absorbencia tan alta. Una "regla de oro" es mantener la absorbancia por debajo de 0,8.
Un último comentario. Es muy difícil determinar con precisión un coeficiente de extinción a partir de gráficos de absorbancia frente a la concentración, a menos que se conozca con exactitud la concentración del material original. Si esta cifra se basa en una medición de "peso seco", para empezar, tendrás que estar seguro de que el compuesto es puro.
Leyendo de nuevo tu pregunta, creo que necesitamos un poco más de detalle experimental, y si pudieras suministrarlo, lo intentaré de nuevo, tal vez.
El NADH se utiliza ampliamente en las ciencias bioquímicas donde (entre otras muchas cosas) el coeficiente de extinción relativamente alto de 6220 M -1 .cm -1 se aprovecha en los ensayos enzimáticos continuos. Si una enzima produce o consume NADH (o NADPH ) entonces es (normalmente) muy fácil diseñar un ensayo.
EDITAR
Parece que el coeficiente de extinción aceptado (Coeficiente de Absorción Molar) para Allura Red AC (Rojo 40) es de unos 25 000 M -1 .cm -1 (o 25 000 mol -1 L cm -1 ) a unos 505 nm. La mejor referencia que puedo conseguir es aquí . Los colorantes azoicos tienden a tener coeficientes de extinción muy altos, por lo que esto "parece correcto
La solución diluida tiene una absorbencia de 0,283
Tomando lo anterior como el coeficiente de extinción, y además suponiendo que la medición se realizó en una cubeta con una longitud de recorrido de 1 cm (l =1), se puede calcular a partir de Beer-Lambert que la concentración de Rojo Allura en la solución diluida es de aproximadamente 11,32 x 10 -6 M.
El factor de dilución es de 4 en 10, o de 1 en 2,5. Por lo tanto, la concentración de la solución original es de aproximadamente 28,3 x 10 -6 M.
